Identificatie van nieuwe DNA schade respons genen
Array
Met behulp van een nieuwe gen-identificatie techniek, waarbij elk gen één voor één tijdelijk wordt uitgeschakeld, zijn door het onderzoek van Joris Pothof vele nieuwe genen geidentificeerd die een belangrijke rol spelen bij het onderhoud van het DNA.
Uitschakeling van deze genen leidt tot een verhoogd aantal mutaties. Het is van belang om zo min mogelijk mutaties in het erfelijk materiaal verwerven: teveel mutaties kan leiden tot het ontstaan van kanker. Veel erfelijke kankersyndromen worden veroorzaakt door defecten in genen, die betrokken zijn bij het vermijden van mutaties in het DNA. Hoewel zulke kanker-geassocieerde genen bekend zijn, zijn nog lang niet alle genen in deze klasse geidentificeerd.
De nieuw gevonden genen kunnen dus een belangrijke rol spelen bij het ontstaan van kanker. Verder onderzoek aan tumor materiaal moet uitwijzen of deze nieuwe genen causaal betrokken zijn bij kanker. Hierdoor wordt niet alleen de kennis omtrent kanker vergroot, maar ook kan dit worden gebruikt voor erfelijkheids-onderzoek bij patienten.
13-10-2005, 12:45 uur , Academiegebouw, Domplein 29, Utrecht.
Joris Pothof, Biologie
Proefschrift: DNA damage responses in Caenorhabditis elegans.
Promotor 1: Prof.dr. R.H.A. Plasterk Copromotor 1: Dr. M. Tijsterman Samenvatting:
Kanker is één van de belangrijkste doodsoorzaken in Nederland en de rest van de westerse wereld. Een normale cel kan pas in een kankercel veranderen nadat deze verscheidene genetische veranderingen heeft ondergaan. Kankercellen hebben twee belangrijke eigenschappen: ongecontroleerde celgroei en de mogelijkheid om andere delen van het menselijk lichaam te kolonialiseren. Om deze potentieel gevaarlijke situatie te vermijden, hebben organismen allerlei beschermingssystemen. Juist deze systemen zijn omzeild in kanker cellen door middel van genetische veranderingen in genen, die essentieel zijn voor deze beschermingssystemen. De normale spontane mutatiefrequentie is echter te laag om al deze genetische veranderingen te bewerkstelligen. Een mogelijke verklaring voor het feit dat deze veranderingen aanwezig zijn, is dat vroeg in de kankerontwikkeling een verhoogde mutatiefrequentie ontstaat door de inactivatie van een gen dat betrokken is bij bijvoorbeeld DNA reparatie. Door deze verhoogde mutatie-frequentie zullen de benodigde genetische veranderingen makkelijker plaatsvinden. Elke keer dat een kanker geassocieerd gen binnen een cel een mutatie oploopt, krijgt deze cel een selectief voordeel om te delen ten opzichte van de rest van de cel populatie. Hierdoor ontstaat een subpopulatie van cellen die beter groeien. Binnen deze subpopulatie kan een cel weer een extra mutatie krijgen in een kanker-geassocieerd gen, dat weer een groei-voordeel oplevert resulterend in een subpopulatie van nog sneller groeiende cellen. Nadat dit process zich enige malen heeft herhaald, onstaat een populatie van cellen die enorm snel groeien en de mogelijkheid hebben om uit te zaaien: kanker. Deze verhoogde mutatie-frequentie kan tot verschillende soorten mutaties leiden: Op het niveau van de nucleotiden in het DNA, hetgeen de chromosoomstructuur en aantallen intact laat, of op het niveau van chromosomen, waarbij men moet denken aan het verlies of toename van gehele chromosomen, grote deleties van chromosoomgedeeltes of de uitwisseling van chromosoomgedeeltes tussen twee chromosomen. Mutaties in genen, die tot de klasse van DNA reparatie en DNA schade respons systemen behoren, leiden tot een verhoogde mutatiefrequentie. Hoewel al veel DNA schade reparatie en respons genen bekend zijn, zijn nog lang niet alle genen in dit proces ontdekt. De ontdekking van deze genen is van groot belang omdat dit mogelijke kanker geassocieerde genen zijn. Maar hoe kan men deze genen identificeren? In dit proefschrift maken we gebruik van het genetische model organisme C. elegans om nieuwe genen in de DNA schade reparatie en respons mechanismen te identificeren. De meeste, al uit de mens bekende, genen zijn ook aanwezig in C. elegans, wat translationele verklaringen mogelijk maakt. Allereerst hebben we de mogelijkheden bekeken om C. elegans als een model organisme te gebruiken in DNA schade en respons onderzoek. In hoofdstuk 2 beschrijven we een gen defect in een reparatie-mechanisme, mismatch repair, dat in mensen betrokken is bij het ontstaan van erfelijke darmkanker (HNPCC). We laten zien dat uitschakeling van dit gen (msh-6) leidt tot een verhoogde mutatiefrequentie. Voornamelijk nucleotide mutaties en deleties of inserties in zogenaamde repetitieve nucleotidevolgorden ontstaan in dieren zonder actief msh-6 gen. We hebben gebruik gemaakt van transgene wormen waarin we heel gemakkelijk dit soort mutaties kunnen zien. In normale dieren observeerden we nauwelijks mutaties, terwijl dieren met een uitgeschakeld msh-6 gen meerdere mutaties per dier opliepen. In hoofdstuk 3 worden de transgene wormen, die beschreven zijn in hoofdstuk 2, gebruikt om nieuwe genen te identificeren welke een verhoogde mutatiefrequentie hebben wanneer ze zijn uitgeschakeld. Hiervoor hebben we een methode gebruikt waarbij, één voor één, bijna alle genen aanwezig in C. elegans worden uitgeschakeld. Met deze methode hebben we 61 genen gevonden wiens uitschakeling leidt tot een verhoogde mutatie-frequentie. We hebben hier ook msh-6 gevonden, zonder voorkennis, wat deze manier van gen-identificatie valideert. Zo hebben we vele DNA schade reparatie en respons genen geidentificeerd, alsmede genen die de structuur van het DNA vormgeven en genen die betrokken zijn bij de celdelings-controle. Ook hebben we veel nieuwe genen gevonden, welke ook aanwezig zijn in het menselijk DNA. Hoofdstuk 4 beschrijft onderzoek naar lin-61, één van de genen uit de screen beschreven in hoofdstuk 3, dat ook aanwezig is in de mens. Een analyse van de structuur laat zien dat er enkele geconserveerde eiwit-domeinen zijn, waarvan de functie onbekend is. Nadat we dit gen hadden uitgeschakeld, observeerden we een verhoogd verlies van gehele chromosomen. Een andere analyse welke kijkt naar lethaliteit in combinatie met andere DNA schade reparatie en respons genen, leidde tot de mogelijkheid dat lin-61 betrokken is bij de celdelings-controle na DNA breuken. Lin-61 defecte dieren zijn inderdaad gevoelig voor geinduceerde DNA breuken. Nadat cellen DNA schade hebben opgelopen, wordt normaliter de celdeling stilgelegd. Wanneer de schade te erg is, pleegt de cel zelfmoord. Beide eigenschappen zijn in kanker cellen niet aanwezig. lin-61 is essentieel voor beide functies. Binding studies met andere genen, leidde tot de conclusie dat lin-61 een deel van een complex is dat de structuur van het DNA beinvloed, waardoor mogelijk gen-expressie van celdelings genen wordt onderdrukt. DNA schade kan onder andere ontstaan door blootstelling aan kankerverwekkende stoffen. Hoofdstuk 5 beschrijft een studie naar genen, welke essentieel zijn voor de bescherming tegen de kankerverwekkende (en DNA schade veroorzakende) stof methyl-methaansulfonaat (MMS). We hebben eenzelfde methode gebruikt zoals beschreven in hoofdstuk 3. In totaal hebben we 86 genen gevonden welke nodig zijn voor de bescherming tegen MMS. Niet alleen DNA schade reparatie en respons genen zijn gevonden, maar ook genen die betrokken zijn bij de detoxificatie van de cel. Verrassend genoeg was er weinig overlap tussen de C. elegans en gist genen, die betrokken zijn bij de bescherming tegen MMS wat suggereert dat deze respons niet geconserveerd is tussen eencellige en meercellige dieren. Visualisatie van de DNA inhoud in embryos waarbij systematisch alle 86 genen waren uitgeschakeld in de aanwezigheid van MMS liet zien dat uitschakeling van sommige genen leidde tot abnormaal gevormde kernen, gefragmenteerde chromosomen en een enorme toename van DNA per kern. Analyse van deze genen laat zien dat dit een proces is waarbij DNA schade respons genen betrokken zijn, alsmede genen die de eiwitten van deze DNA schade respons genen modificeren en daardoor activeren.
Bron: Universiteit Utrecht
